본 발명에 따른 다층 3차원 세포배양체 형성유닛을 이용한 다층 3차원 세포배양체 형성시스템 및 다층 3차원 세포배양체 형성방법은, 다수의 세포층으로 구성되는 3차원 세포배양체를 형성하는 다층 3차원 세포배양체 형성유닛으로서, 상기 세포배양체의 스페로이드를 형성하기 위한 제1 주사액이 이동되는 경로부, 상기 제1 주사액이 상기 경로부를 따라 이동되며 상기 세포배양체를 형성하기 위한 행잉드롭이 형성되는 형성부 및 상기 형성부의 둘레와 기 설정된 간격만큼 이격되도록 배치되고, 제2 주사액이 주입되며 상기 제1 행잉드롭을 표면장력에 의해 상기 제1 행잉드롭을 확장시키는 확장부를 포함하는 다층 3차원 세포배양체 형성유닛을 이용한 다층 3차원 세포배양체 형성시스템 및 다층 3차원 세포배양체 형성방법을 제공한다.